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Espressione dell’attivatore del recettore del ligando del fattore-kB nucleare in cellule mononucleate del sangue periferico in pazienti con neuroartropatia acuta di Charcot

La neuroartrosi di Charcot (CN) si verifica in genere nel piede / alla caviglia di pazienti diabetici con neuropatia sensoriale ed √® una causa comune di morbilit√† in questa popolazione.¬†Questa malattia pu√≤ portare ad una grave amputazione dei piedi: in questi casi, l’osteomielite √® stata descritta come meccanismo scatenante dello sviluppo di CN, pertanto un’efficace terapia antibiotica potrebbe avere un ruolo positivo nel corso della malattia.¬†La CN √® presto caratterizzata da un’infiammazione acuta che pu√≤ causare osteopenia, riassorbimento osseo e indebolimento osseo che successivamente possono portare a alterazioni ossee croniche come fratture, lussazioni, instabilit√† e deformit√† grossolane¬†1¬†–¬†3.¬†Infatti, l’infiammazione locale √® associata al rilascio di citochine proinfiammatorie come l’interleuchina (IL) -1alfa e il fattore di necrosi tumorale (TNF) -alfa, che sono noti mediatori del riassorbimento osseo tramite attivit√† osteoclastica in eccesso¬†4¬†,¬†5.¬†Queste citochine portano ad una maggiore espressione dell’attivatore del recettore del ligando nucleare factor-kB (RANK) (RANK-L).¬†Il suo recettore (RANK) √® espresso nella membrana dei preosteoclasti.¬†Il RANK-L stimola l’espressione del fattore nucleare (NF) -kB che, a sua volta, induce la maturazione delle cellule precursori in osteoclasti maturi.¬†Allo stesso tempo, NF-kB induce la glicoproteina osteoprotegerina (OPG), che agisce come recettore di decoy per RANK-L per evitare l’osteolisi in eccesso.¬†Il ruolo di questa via nella patogenesi acuta di CN √® supportato dal fatto che lo stesso sistema RANK / RANK-L / OPG √® anche coinvolto nel processo di calcificazione arteriosa mediale una caratteristica fortemente associata a CN¬†6¬†,¬†7¬†.¬†Le cellule T e B attivate sono fonti ben riconosciute di RANK-L e OPG¬†8,¬†9¬†, e pu√≤ contribuire a riassorbimento osseo patologico visto nelle malattie infiammatorie croniche come l’artrite reumatoide (RA), periodontite e la malattia infiammatoria intestinale¬†10¬†–¬†13¬†.¬†Il CN acuto non √® associato con l’infiammazione sistemica¬†14¬†, tuttavia, i monociti periferici da pazienti con CN acuta possono mostrare cambiamenti pro-infiammatori¬†15 .¬†Sulla base di queste evidenze, in questo studio l’espressione di RANK-L e OPG √® stata studiata in cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da pazienti con CN acuto e correlata con i marcatori clinici e radiologici dell’attivit√† della malattia.¬†Abbiamo trovato che l’espressione di RANK-L era inferiore nei pazienti con CN acuto rispetto ai soggetti di controllo diabetici e ai soggetti sani di controllo;¬†mentre l’espressione di OPG non √® stata rilevata nei pazienti e in entrambi i gruppi di controllo.¬†L’espressione di RANK-L all’inizio della malattia era inversamente correlata all’indice di polinsaturazione (PUI), un indice misurabile derivato dal midollo osseo che consente la valutazione dell’attivit√† della malattia nella CN acuta¬†16e tempo di recupero.¬†Infine, l’espressione di RANK-L √® aumentata al momento della guarigione rispetto ai valori rilevati durante la fase acuta.

Reclutamento dei pazienti

Nove pazienti diabetici con CN acuta sono stati arruolati in modo prospettico nello studio.¬†La CN acuta √® stata definita sulla base dei seguenti segni clinici e MRI: inspiegabile, relativamente indolore, aumento del gonfiore di un piede e della caviglia, aumento della temperatura della pelle di almeno 2 ¬į C rispetto al piede controlaterale (delta-T), instabilit√† clinica dovuta a lesione legamentosa / trauma occulto, presenza di edema tipico del midollo osseo sulla risonanza magnetica.¬†Tutti i pazienti erano nello stadio 0, secondo¬†Eichenholtzsistema di palcoscenico ed erano privi di qualsiasi osso strutturale o alterazione articolare, come documentato da valutazione tomografica computerizzata, ulcere del piede attivo e / o segni di infezione dei tessuti molli.¬†Tutti i pazienti hanno avuto un coinvolgimento unilaterale del piede come documentato dalla risonanza magnetica (nessuna evidenza di edema del midollo osseo), oltre alla valutazione clinica.¬†Tutti i pazienti presentavano una grave polineuropatia sensoriale periferica.¬†La presenza di neuropatia periferica √® stata valutata mediante la soglia di percezione delle vibrazioni (VPT espressa in Volt) e l’indice di neuropatia diabetica (DNI).¬†La neuropatia periferica √® stata definita da un VPT ‚Č•25 Volt e / o da un punteggio DNI positivo> 2 punti¬†17.¬†In seguito alla diagnosi di CN acuta, tutti i pazienti sono stati sottoposti a scaricamento e immobilizzazione del piede mediante getto di contatto totale seriale con progressione verso cast castatori rimovibili.¬†Il recupero √® stato definito dalla scomparsa dell’edema del midollo osseo, come dimostrato dalla RMN, utilizzando immagini TIR (TIR) ‚Äč‚Äčcon recupero dell’inversione del tao corto pesate in T2.¬†√ą stato anche studiato un gruppo (n = 9) di pazienti diabetici con polineuropatia sensoriale periferica, senza evidenza clinica e radiologica della storia della NC.¬†Sono stati inclusi anche controlli sani (n = 9) senza evidenza di diabete mellito (in base all’assenza di farmaci antidiabetici auto-riportati).¬†Questo studio √® stato condotto secondo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki e approvati dal nostro comitato di revisione istituzionale.

RT-PCR

L’RNA totale √® stato isolato nei pazienti e nei controlli entro 24 ore dall’incontro dei criteri di iscrizione utilizzando l’uso del kit RNeasy Plus Mini (Qiagen, Hombrechtikon, Svizzera), comprensivo della digestione con DNasi-I e quindi dell’etanolo precipitato.¬†La quantificazione dell’RNA isolato √® stata eseguita mediante determinazione spettrofotometrica (Gene Quant II, Pharmacia, Uppsala, Svezia).¬†RNA totale √® stato retrotrascritto al cDNA utilizzando Omniscript RT Kit (Qiagen): RNA (1 microgrammo) √® stato aggiunto a una provetta contenente 2 microlitri 10x tampone RT, 2 microlitri dNTP Mix (5 mM ogni dNTP), 2 microlitri Oligo dT primer (10microM), 2 microlitri Esameri random (100microM), 1microliter inibitore Qiagen-RNase (10 unit√† / microl), 1microliter Omniscript Reverse Transcriptase (4 unit√† / microl), quantit√† variabile di acqua senza RNasi in un volume di reazione totale di 20 microlitri.¬†Le condizioni di incubazione erano 60 min a 37 ¬į C.¬†Le diluizioni seriali del cDNA sono state amplificate mediante PCR utilizzando AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase (Applied Biosystems): cDNA √® stato aggiunto a una provetta contenente 5 microlitri 10x AmplTaq Gold 360 Buffer, 5 microlitri 25mM Magnesium Chloride, 4 microlitri dNTP Mix (2,5 mM ogni dNTP), 1 microlitro di ciascun primer (25microM), 0,25 microlitri AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase (5 unit√† / microlitro), acqua per PCR in un volume di reazione totale di 50 microlitri.¬†La reazione √® stata eseguita su GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems).¬†Primer umani specifici per mRNA da geni RANK-L e OPG sono stati utilizzati in PCR, la beta-actina √® stato il gene housekeeping selezionato come standard interno.¬†I primer utilizzati erano: RANK-L forward, 5′-CAGATGGATCCTAATAGAAT-3 ‘, RANK-L reverse, 5′-ATGGGAACCAGATGGGATGTC-3’, OPG forward, 5 ‘¬†-ATGAACAAGTTGCTGTGCTG-3 ‘, OPG reverse, 5′-GCAGAACTCTATCTCAAGGTA-3′, beta-actin forward, 5’-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3 ‘, beta-actin reverse, 5′-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’.¬†Il profilo termico per amplificare il DNA era: denaturazione iniziale a 95 ¬į C per 10 min seguita da un numero selezionato di cicli costituiti da denaturazione a 95 ¬į C per 1 min, ricottura (a temperatura dipendente dalla temperatura di fusione T di ciascuna coppia di primer) per 30 sec, estensione a 72 ¬į C per 1 min, con un’estensione finale a 72 ¬į C per 7 min.¬†La temperatura di ricottura era: 54 ¬į C per OPG, 46 ¬į C per RANKL, 58 ¬į C per beta-actina.¬†Il numero di cicli era: 35 per RANK-L, 50 per OPG, 21 per beta-actina.¬†La lunghezza del prodotto di amplificazione era: 324 bp per RANK-L, 354 bp per OPG, 452 bp per beta-actina.¬†L’assenza di contaminazione del DNA nella preparazione dell’RNA √® stata verificata effettuando l’amplificazione PCR locus HLA-DQa 1 (primer forward GH26, 5-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3 ‘, primer inverso GH27, 5′-CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTG-3’, temperatura di ricottura 60 ¬į C, dimensione di prodotto 242 bp, o 239 bp da alcuni alleli).¬†10ml del prodotto di amplificazione da ciascuna PCR sono stati separati su gel di agarosio all’1,8%, colorati con bromuro di etidio e visualizzati mediante irradiazione UV.¬†Le bande di bromuro di etidio sono state acquisite mediante scansione e quantificate mediante analisi di immagini con Multi-Analyst / PC (software per PC per Image Analysis Systems 1.1 di Bio-Rad.)¬†o 239 bp da alcuni alleli).¬†10ml del prodotto di amplificazione da ciascuna PCR sono stati separati su gel di agarosio all’1,8%, colorati con bromuro di etidio e visualizzati mediante irradiazione UV.¬†Le bande di bromuro di etidio sono state acquisite mediante scansione e quantificate mediante analisi di immagini con Multi-Analyst / PC (software per PC per Image Analysis Systems 1.1 di Bio-Rad.)¬†o 239 bp da alcuni alleli).¬†10ml del prodotto di amplificazione da ciascuna PCR sono stati separati su gel di agarosio all’1,8%, colorati con bromuro di etidio e visualizzati mediante irradiazione UV.¬†Le bande di bromuro di etidio sono state acquisite mediante scansione e quantificate mediante analisi di immagini con Multi-Analyst / PC (software per PC per Image Analysis Systems 1.1 di Bio-Rad.)

Esami MR

La MRS e la RM sono state eseguite utilizzando un sistema di scanner 3-T (Achieva, Philips Medical Systems, Best, Paesi Bassi).¬†La presenza o l’assenza di edema del midollo osseo all’interno di diverse ossa del piede e della caviglia √® stata determinata utilizzando immagini TIR (TIR) ‚Äč‚Äčcon recupero di inversione di breve durata (STIR) acquisite nei piani coronale, assiale e sagittale.¬†I dati spettroscopici sono stati ottenuti come descritto in precedenza utilizzando una sequenza spettroscopica a singolo punto di voxel (PRESS) come precedentemente descritto¬†16.¬†In breve, la sequenza PRESS √® stata soppressa con acqua utilizzando un impulso di eccitazione selettivo per schiacciare il segnale dell’acqua.¬†La dimensione voxel (volume di interesse, VOI) era 1,3 √ó 1,3 √ó 1,3 cm3.¬†Le operazioni di determinazione della frequenza, di ottimizzazione della potenza e di spessoramento completamente automatizzate sono state eseguite nel VOI.¬†Per confermare la riproducibilit√† delle misurazioni, sono stati ripetuti tre insiemi di acquisizione degli spettri tre volte ciascuno in quattro 4 pazienti e sei 6 soggetti di controllo.¬†I dati sono stati analizzati utilizzando il pacchetto software jMRUI v4.0¬†18¬†.¬†I metaboliti da stimare sono stati definiti con un database di riferimento di picchi noti¬†19¬†.¬†Gli spettri acquisiti sono stati analizzati utilizzando l’algoritmo di AMARES.¬†L’indice del rapporto metabolita della poli-insaturazione (PUI) √® stato definito come descritto in precedenza¬†16¬†.

Risultati clinici

Le caratteristiche cliniche generali dei diversi gruppi di pazienti sono presentate nella¬†Tabella¬†1¬†.¬†L’et√† media, rapporto maschi-femmine era simile tra pazienti con CN acuto e soggetti di controllo diabetici (p> 0,05 e p> 0,05, rispettivamente) o partecipanti di controllo sani (p> 0,05 e p> 0,05, rispettivamente).¬†Inoltre, il tempo trascorso dall’esordio del diabete e la percentuale di Hba1c non erano diversi tra pazienti affetti da CN acuto e soggetti con controllo diabetico (p> 0.05 e p> 0.05, rispettivamente).¬†Tutti i pazienti diabetici erano in terapia insulinica.¬†Il sito della lesione nei pazienti con CN acuta era il piede posteriore, n = 6;¬†met√† del piede, n = 3 e il tempo medio di guarigione sulla risonanza magnetica era di 8,14 ¬Ī 3,7 mesi.

 Tabella 1Caratteristiche generali dei pazienti dello studio

Charcot Diabete Controlli sani
Et√† (anni, media ¬Ī DS) 54,4 ¬Ī 4,5 60.11 ¬Ī 4.3 48,89 ¬Ī 5,1
Sesso (maschio: femmina) 3: 6 4: 5 5: 4
Tipo 1: diabete di tipo 2 6: 3 5: 4 n / A
Tempo trascorso dall’esordio del diabete (anni, media ¬Ī DS) 18,34 ¬Ī 11,3 22,7 ¬Ī 12,5 n / A
Hba1c (%, media ¬Ī SD) 7.4 ¬Ī 3.1 8.1 ¬Ī 2.2 n / A

Nota. na = non applicabile

Espressione RANK-L e OPG in PBMC

La RT-PCR semi-quantitativa √® stata eseguita su RNA totale estratto da PBMC in pazienti con CN acuto, soggetti di controllo diabetico e partecipanti di controllo sani.¬†Come mostrato nella¬†Figura¬†1¬†, l’espressione di RANK-L √® stata rilevata nella totalit√† dei pazienti e dei controlli, ma era significativamente pi√Ļ bassa nei pazienti rispetto ai controlli, come dimostrato dalla valutazione densitometrica dei prodotti di amplificazione da PCR.¬†Nessuna differenza significativa nell’espressione di RANK-L √® stata documentata tra soggetti di controllo diabetici e partecipanti di controllo sani.¬†Espressione di OPG abbondante √® stata evidenziata nella linea di cellule positive di controllo U937 ma, a differenza di RANK-L, non √® stata rilevata alcuna espressione di OPG in PBMC da pazienti e controlli.

L’espressione RANK-L √® correlata con PUI e tempo di recupero

Abbiamo poi studiato se l’espressione di RANK-L nei pazienti acuti di CN fosse correlata con PUI e tempo di guarigione alla risonanza magnetica.¬†L’analisi di correlazione di Pearson ha mostrato che l’espressione di RANK-L era inversamente correlata con i livelli di PUI (r = -0.7072, intervallo di confidenza del 95% = -0.9331 a -0.0810,¬†P¬†= 0.033) e tempo di recupero (r = -0.7878, intervallo di confidenza al 95% = – Da 0,9532 a -0,2592,¬†P¬†= 0,011) (¬†Fig.¬†2¬†).

Il recupero dal CN acuto √® associato ad un aumento dell’espressione di RANK-L

L’espressione di RANK-L √® stata analizzata in sei pazienti durante la fase acuta della CN e al momento della scomparsa dell’edema del midollo osseo (¬†Fig.¬†3¬†).¬†La valutazione densitometrica dei prodotti di amplificazione da PCR non ha mostrato una differenza significativa dell’espressione RANK-L tra i due punti temporali;¬†tuttavia, in tutti i pazienti l’espressione di RANK-L √® aumentata al momento della guarigione rispetto ai valori rilevati durante la fase acuta.

¬†Figura 1RT-PCR L’espressione RANK-L nelle tre tipologie di soggetti studia: controlli sani, controlli diabetici e pazienti con Charcot.

Immagine Int Medica Int J¬†(Clicca sull’immagine per ingrandirla.)

¬†figura 2RT-PCR Espressione RANK-L in pazienti acuti di Charcot valutati sulla base dell’indice di polinsaturazione (PUI) e del tempo di guarigione sulla risonanza magnetica.

Immagine Int Medica Int J¬†(Clicca sull’immagine per ingrandirla.)

¬†Figura 3Espressione di RANK-L analizzata in pazienti Charcot in 2 tempi: durante la fase acuta della neuropatia di Charcot e al momento della scomparsa dell’edema del midollo osseo.

Immagine Int Medica Int J¬†(Clicca sull’immagine per ingrandirla.)

Discussione

Il coinvolgimento del riassorbimento osteoclastico mediato da RANK-L nella CN acuta √® supportato da diversi studi¬†6¬†,¬†7¬†.¬†Il sistema immunitario adattativo influisce potenzialmente sullo scheletro attraverso una convergenza di cellule immunitarie e effettori di citochine, mediando funzioni critiche in entrambi i sistemi di organi e formando l ‘”interfaccia immuno-scheletrica”.¬†In condizioni infiammatorie sia le cellule B che le cellule T possono essere considerevoli fonti di RANK-L e possono contribuire al riassorbimento osseo patologico¬†10¬†–¬†13.¬†Tuttavia, nel CN ‚Äč‚Äčacuto la risposta infiammatoria locale correlata all’aumentata secrezione di citochine proinfiammatoria non √® associata a una sindrome infiammatoria sistemica (14).¬†Qui abbiamo trovato che l’espressione di RANK-L era inferiore in PBMC da pazienti con CN acuta rispetto a soggetti di controllo diabetici e controlli sani.¬†Questi dati suggeriscono l’esistenza di un meccanismo immunoregolatore compensatorio per limitare potenzialmente il riassorbimento osseo durante la CN acuta.¬†La modulazione in basso dell’espressione RANK-L pu√≤ essere ottenuta riducendo la produzione di citochine come IL-18, IL-1beta e TNF-alfa, che aumentano la produzione di RANK-L da parte dei linfociti¬†20¬†, o aumentando la secrezione di citochine, come IL-27, in grado di inibire l’espressione di RANK-L su cellule T¬†21¬†–¬†24.¬†Al contrario di RANK-L, nessuna espressione di OPG √® stata rilevata nelle cellule da pazienti e controlli.¬†Ci√≤ non sorprende poich√© i linfociti esprimono l’OPG solo dopo l’attivazione in risposta alla sfida dell’antigene, che non √® un meccanismo patogenetico della CN acuta.¬†In particolare, l’assenza di OPG espressione da PBMC √® coerente con l’intenso riassorbimento osseo che caratterizza la fase acuta di CN.

Il CN acuto si presenta tipicamente con un’infiammazione acuta o sub acuta del piede.¬†Il dolore pu√≤ o non pu√≤ essere presente, a seconda della presenza di danni ai nervi¬†5¬†.¬†Non c’√® n√© febbre n√© alcuna sindrome infiammatoria biologica importante, e questa presentazione clinica ha spesso portato a diagnosi imprecise o ritardate, con conseguente progressione verso la fase cronica con deformazione irreversibile.¬†Il riconoscimento precoce di CN pu√≤ salvare un lungo periodo di sofferenza per il paziente, costi ospedalieri elevati e, in definitiva, l’amputazione.¬†Tuttavia, in questa fase della malattia, la radiografia standard spesso non √® in grado di distinguere il CN acuto da altre condizioni.¬†La scintigrafia ossea radioisotopica del tecnezio (TC-99m) ha una buona sensibilit√† ma scarsa specificit√† per la patologia ossea¬†25.¬†La risonanza magnetica √® in grado di evidenziare un’infiammazione nell’osso e nei tessuti molli adiacenti, ma √® piuttosto costosa e richiede un alto livello di competenza dall’esaminatore¬†26¬†.¬†I dati presentati qui suggeriscono che la valutazione dell’espressione di RANK-L nei globuli periferici potrebbe rappresentare un possibile nuovo strumento diagnostico.¬†Tuttavia, la diagnosi differenziale di CN acuta deve essere effettuata con infezioni (osteomielite, cellulite, artrite settica) e infiammazioni (ad esempio la gotta).¬†Non abbiamo valutato l’espressione di RANK-L in soggetti con infezione o infiammazione diversa dalla CN, quindi il lavoro futuro dovrebbe concentrarsi, oltre che sull’analisi di conferma, sulla discriminazione dell’infezione / dell’infiammazione rispetto a CN.

Fino ad oggi la valutazione dei pazienti acuti di CN si √® basata su segni infiammatori locali come temperatura cutanea, gonfiore ed eritema¬†5¬†,¬†27¬†,¬†28¬†.¬†I segni clinici locali sono utili per guidare il medico a passare dal cast ad altri dispositivi per alleviare la pressione.¬†Tuttavia, sono affetti da scarsa specificit√† e riproducibilit√† e la loro utilit√† nel fornire una misura del livello di attivit√† della malattia √® stata recentemente messa in discussione¬†29¬†,¬†30.¬†La mancanza di criteri specifici e indici oggettivi in ‚Äč‚Äčgrado di valutare l’attivit√† della malattia durante il follow-up, oltre ad essere un ostacolo all’attuazione delle attuali opzioni terapeutiche fisiche, ha limitato anche la ricerca sui trattamenti farmacologici per la CN acuta.¬†Recentemente, la risonanza magnetica √® stata introdotta nella valutazione della CN acuta.¬†In particolare, la scomparsa dell’edema del midollo osseo come valutato sulle immagini STIR si √® rivelata utile per valutare il recupero della malattia¬†31¬†.¬†Tuttavia, durante il periodo tra l’inizio della malattia (presenza di edema del midollo osseo) e il recupero (assenza di edema del midollo osseo) la regressione dell’edema del midollo osseo √® difficile da quantificare¬†32¬†.¬†L’uso della risonanza magnetica contrastata √® stato sostenuto¬†32¬†,¬†34.¬†Tuttavia, nei pazienti diabetici non sono sempre possibili esami ripetuti con mezzo di contrasto¬†34¬†.¬†In questo contesto clinico, un indice quantitativo non invasivo sarebbe altamente desiderabile per monitorare l’attivit√† della malattia.¬†A questo proposito, mostriamo qui che il grado di espressione di RANK-L in PBMC da pazienti affetti da CN acuta √® correlato all’intensit√† dell’infiammazione del midollo osseo, valutata dalla MRS.¬†Inoltre, l’espressione di RANK-L era significativamente pi√Ļ bassa nei pazienti il ‚Äč‚Äčcui edema del midollo richiedeva pi√Ļ tempo per risolversi.¬†Infine, dopo la sparizione dell’edema del midollo osseo, l’espressione di RANK-L valutata su base singola paziente √® aumentata rispetto ai valori ottenuti all’inizio della malattia.

Conclusioni

In conclusione, i nostri dati preliminari forniscono un primo passo nell’applicazione dell’analisi dell’espressione di RANK-L nelle cellule del sangue periferico alla diagnosi di CN acuta.¬†L’espressione RANK-L potrebbe essere correlata a una vasta gamma di patologie ossee degenerative, come l’artrite reumatoide, pertanto √® necessario eseguire una diagnosi differenziale adeguata.¬†La patogenesi della CN rimane incerta e tuttavia, sulla base dei nostri dati, suggeriamo che l’analisi dell’espressione RANK-L potrebbe essere uno strumento complementare che pu√≤ essere impiegato per ottenere parametri quantitativi che possono aiutare i medici a monitorare l’attivit√† della malattia nei pazienti con CN acuta.

[Tratto da: www.medsci.org ]

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