Il fattore di crescita trasformante β svolge un ruolo importante nel migliorare la guarigione delle ferite mediante l’applicazione topica di ioduro di Povidone

Astratto

Il Povidone-iodio (PVI) viene principalmente utilizzato come agente antimicrobico. È stato scoperto che lo 0,5% di PVI può attenuare congestione, edema e dolore indotto da piaghe da decubito. Pertanto, questo studio mirava a valutare gli effetti dello 0,5% di PVI sulle ferite acute della pelle. Quattro ferite escissive a tutto spessore sono state generate sulla pelle dorsale di ratti Sprague-Dawley maschi con un punch sterile da 10 mm. Due ferite non sono state curate e le altre due sono state rivestite con una garza con lo 0,5% di PVI per 1 ora al giorno per i primi 5 giorni dopo l’infortunio. Sono state inoltre generate ferite da escissione a tutto spessore di 10 mm sulla cute dorsale di ratti trattati con SB431542 da 10 mg / kg e tutte le ferite sono state trattate con PVI allo 0,5% per 5 giorni. Il trattamento con PVI ha migliorato la guarigione delle ferite attraverso la promozione dell’espressione di α SMA e TGF β, neovascolarizzazione e riepitelizzazione. L’interleuchina 6 è stata ridotta dopo il trattamento con PVI. L’inibizione del TGF β ha abolito l’effetto del trattamento PVI sulla chiusura della ferita. Questi dati mostrano che l’applicazione topica dello 0,5% di PVI potrebbe promuovere la guarigione della ferita della pelle acuta attraverso l’aumento dell’espressione di TGF β che porta ad una maggiore formazione di tessuto di granulazione, anche in assenza di infezione evidente.

Introduzione

I trattamenti locali per le ferite della pelle mirano a prevenire l’infezione e migliorare la guarigione della ferita. Gli agenti ideali hanno proprietà anti-microbiche e di promozione della guarigione delle ferite, oltre che il potenziale per un’applicazione topica facile ed estesa in ambito clinico. Il disinfettante Povidone-iodio (PVI) è l’agente topico più comunemente utilizzato per la sterilizzazione della pelle, anche in ambito chirurgico 1 , 2 . Vari disinfettanti costituiti con iodio sono stati segnalati per produrre effetti sulla guarigione della ferita della pelle attraverso meccanismi multipli, tra cui la prevenzione della crescita batterica, l’accelerazione della formazione del tessuto di granulazione 3 ,4 , 5 , 6 , 7 , ecc. Recentemente, Kanno et al.. ha dimostrato che l’1% di polivinilpirrolidone-iodio può favorire la guarigione delle ferite contaminate poiché riduce la conta batterica della ferita e migliora la riepitelizzazione 8 , 9 . Diversi prodotti misti contenenti iodio, come Repithel (PVP-ILH), una nuova formulazione idrogel liposomiale con polivinilpirrolidone-iodio, sono stati anche segnalati per prevenire l’infezione e promuovere la guarigione di ferite croniche, ustionate, infette o contaminate, anche se il contenuto di iodio nella formulazione mista è spesso superiore a quella dei disinfettanti contenenti iodio nell’uso clinico 10 , 11. Abbiamo scoperto che il disinfettante PVI allo 0,5% potrebbe attenuare congestione, edema e dolore indotto da piaghe da decubito. Tuttavia, gli effetti del disinfettante PVI allo 0,5% sulla guarigione della ferita cutanea acuta rimangono sconosciuti. Pertanto, in questo studio sono state create ferite cutanee a tutto spessore per valutare l’effetto dello 0,5% di PVI sul processo di guarigione della ferita e sui meccanismi sottostanti nei ratti.

Risultati

Il trattamento con PVI ha migliorato la chiusura della ferita e ha favorito la formazione e la maturazione dei tessuti di granulazione

Immagini di ferite della pelle da controllo e ratti trattati con PVI sono mostrati in Fig.  1A . Le percentuali di guarigione delle ferite in entrambi i gruppi sono mostrate in Fig.  1B . Le curve curative (Fig.  1B) dimostrano che c’è stata una rapida accelerazione della guarigione nelle ferite trattate con PVI al giorno 5, 8 e 11 post-lesione (p <0,05). Al terzo giorno post-lesione, il campo della ferita ha mostrato abbondanti globuli rossi e alcune infiltrazioni cellulari infiammatorie. Al giorno 5, il sottile tessuto di granulazione immatura, dominato da cellule infiammatorie e nuovi vasi sanguigni e con pochi fibroblasti e deposito di collagene, era presente nell’area della ferita cutanea. Al giorno 8 e 11, la ferita di guarigione consisteva in un tessuto di granulazione moderatamente denso, con un numero maggiore di fibroblasti e deposizione di collagene, più neovascolarizzazione, minima formazione moderata dello strato epiteliale e poche cellule infiammatorie nello strato epiteliale possono essere osservate nell’area della ferita. Il 14 ° giorno dopo l’infortunio si è passati a un tessuto di granulazione maturo e denso caratterizzato da collagene compatto parallelo allo strato epiteliale completo ben formato e a un numero ridotto di fibroblasti e nuovi vasi sanguigni. Tutti questi cambiamenti erano più pronunciati nelle ferite trattate con PVI che nelle ferite di controllo (Fig. 1C ).

Figura 1
Figura 1

Il trattamento con Povidone-iodio (PVI) ha migliorato la chiusura della ferita cutanea e la formazione e la maturazione del tessuto di granulazione. ( A ) Fotografie rappresentative di ferite da un ratto di controllo e trattato con PVI. ( B ) Contrazione delle ferite (%) al giorno 1-14 dopo l’infortunio. ( C ) Micrografie rappresentative di sezioni di ferite macchiate di H & E. Le frecce rosse indicano i globuli rossi. Le frecce blu indicano le cellule infiammatorie. Le frecce grigie indicano fibroblasti. Gli asterischi rossi indicano nuovi vasi sanguigni. Barra della scala = 50 μm. * p <0,05, ** p <0,01 vs controllo. I dati sono mezzi ± SD, n = 12.

Il trattamento con PVI ha promosso l’espressione di actina del muscolo liscio alfa (α-SMA) nelle ferite

L’α-SMA è un marcatore noto di cellule miofibroblastiche nella pelle, che svolgono ruoli importanti nella chiusura delle ferite cutanee. Come mostrato nella figura  2A , l’espressione α-SMA ha raggiunto il picco al giorno 8 dopo l’infortunio. Il trattamento con PVI ha migliorato l’espressione α-SMA ai giorni 5 e 8 rispetto ai controlli, come dimostrato dall’immunoistochimica (p <0,01) (Figura  2B ), che è stata confermata dall’analisi dell’espressione di α-SMA con western blotting (Fig.  2C, D ) .

figura 2
figura 2

Il trattamento con Povidone-iodio (PVI) promuove l’espressione dell’actina del muscolo liscio alfa (α-SMA). ( A ) Rappresentante sezioni di ferite macchiate immunoistochimiche α-SMA da un ratto di controllo e trattato con PVI. Barra della scala = 50 μm. ( B ) Analisi semi-quantitativa dell’espressione di α-SMA. ( C ) Western blotting rappresentativo per α-SMA nelle aree delle ferite. ( D ) Analisi semi-quantitativa dell’espressione di α-SMA, n = 4. * p <0,05, ** p <0,01 vs controllo. I dati sono mezzi ± SD, n = 24.

Il trattamento con PVI ha migliorato la neovascolarizzazione nelle ferite

CD34 è un marker di cellule progenitrici endoteliali (EPC). Le cellule CD34 + sono comparse nelle aree della ferita al terzo post-infortunio e hanno raggiunto il picco al 5 ° giorno, per poi diminuire gradualmente nel tempo (Fig.  3A ), le cellule CD34 + erano quasi inesistenti nell’area della ferita cutanea al giorno 11 e 14 (dati non mostrati Qui). Le ferite trattate con PVI hanno mostrato un aumento significativo delle cellule CD34 + rispetto ai controlli al 5 ° giorno (p <0,01) e al giorno 8 (p <0,05) post-lesione (Fig.  3B ).

Figura 3
Figura 3

Il trattamento con Povidone-iodio (PVI) ha favorito la neovascolarizzazione della ferita. ( A ) Rappresentante sezioni di ferite CD34 immunoistochimiche da un controllo e ratto trattato con PVI. Barra della scala = 50 μm. ( B ) Analisi semiquantitativa della densità capillare (/ mm 2 ). La densità capillare è stata valutata contando il numero di microvasi CD34 positivi in ​​campi ad alta potenza (40x). * p <0,05, ** p <0,01 vs controllo. I dati sono mezzi ± SD, n = 24.

Il trattamento con PVI ha promosso l’espressione β di fattore di crescita trasformante (TGF)

Il TGF-β viene rilasciato nelle aree della ferita in seguito a danno tissutale, attraverso la degranulazione piastrinica che svolge un ruolo chiave nel processo di guarigione delle ferite. Il TGF-β è stato rilevato 1 giorno dopo l’infortunio, gradualmente aumentato nel tempo ed era più alto nelle ferite trattate con PVI rispetto alle ferite di controllo (Fig.  4A, B ).

Figura 4
Figura 4

Il trattamento con Povidone-iodio (PVI) ha aumentato l’espressione di fattore di crescita trasformante β. ( A ) Western blotting rappresentativo per trasformare il fattore di crescita (TGF) β nelle aree della ferita. ( B ) Analisi semi-quantitativa dell’espressione di TGF-β. * p <0.05 vs controllo. I dati sono mezzi ± SD, n = 4.

Gli effetti del trattamento PVI sull’infiltrazione / accumulo di macrofagi nelle aree della ferita

La fase infiammatoria, quando le cellule, compresi i neutrofili e i macrofagi, vengono reclutate nel sito della ferita, è la prima fase della guarigione della ferita. Principalmente derivati ​​da monociti ematici e macrofagi residenti, i macrofagi nelle aree della ferita possono essere rilevati usando CD68 + come marker. Come mostrato dalla figura  5A , i macrofagi sono stati trovati al giorno 1 post-lesione, hanno raggiunto il picco al giorno 2 e diminuiti nel tempo dopo il giorno 3. Il numero di cellule CD68 + nelle ferite trattate con PVI era simile a quello delle ferite di controllo al giorno 1, 2, 3 e 5 post-lesione (figura  5B ).

Figura 5
Figura 5

L’effetto del trattamento con iodio-povidone (PVI) sui macrofagi. ( A ) sezioni di ferita con colorazione immunoistochimica CD68 rappresentativa. Barra della scala = 50 μm. ( B ) Analisi quantitativa di cellule CD68 + (/ campi ad alta potenza). ( C ) Rappresentazione immunoistochimica inducibile nitrico ossido sintasi (iNOS) sezioni della ferita macchiata. Barra della scala = 50 μm. ( D ) Analisi quantitativa di celle iNOS + (/ campi ad alta potenza). I dati sono mezzi ± SD, n = 24.

L’ossido nitrico sintasi indotto (iNOS) è stato utilizzato come marker dei macrofagi M1. Il numero di cellule iNOS + nelle aree delle ferite trattate con PVI non era inferiore a quello nelle aree di controllo delle ferite a 2 °, 3 ° e 5 ° giorno post-lesione (p> 0,05) (Fig.  5C, D ).

Gli effetti del trattamento PVI sul fattore di necrosi tumorale α e sul rilascio di interleuchina 6 nelle aree della ferita

Il fattore di necrosi tumorale (TNF) α viene prodotto precocemente nelle ferite dopo l’insulto, principalmente dai macrofagi M1. Il TNFa si trovava in gran parte nel citoplasma delle cellule (Figura  6A ). Il numero di cellule TNFα + nelle ferite trattate con PVI non differiva da quello delle ferite di controllo, come mostrato in Fig.  6B (p> 0.05).

Figura 6
Figura 6

L’effetto del trattamento con povidone-iodio (PVI) sul fattore di necrosi tumorale (TNF) α e sull’interleuchina (IL) -6 nel sito della ferita. ( A ) sezioni di ferita rappresentate TNFa immunoistochimiche rappresentative. Barra della scala = 50 μm. ( B ) Analisi semi-quantitativa di cellule TNFα + (/ campi ad alta potenza). ( C ) Rappresentante sezioni di ferita con colorazione immunoistochimica IL-6. Barra della scala = 50 μm. ( D ) Analisi semi-quantitativa dell’espressione di IL-6. ** p <0,01 vs controllo. I dati sono mezzi ± SD, n = 24.

Le cellule infiammatorie compresi i neutrofili ei monociti si infiltrano nella ferita e rilasciano citochine che partecipano al processo di guarigione. IL-6 non è stato rilevato nell’area della ferita al post-infortunio del primo giorno (dati non mostrati), ma ha raggiunto il picco al giorno 3 (Fig.  6C ), e poi gradualmente diminuito, in modo tale che non era presente nell’area della ferita al giorno 8 e 11 post-lesione (dati non mostrati). Gli animali trattati con PVI hanno mostrato una significativa riduzione del livello di IL-6 della ferita rispetto agli animali di controllo al terzo post-infortunio (p <0,01) (Fig.  6D ).

Il trattamento con PVI promuove la differenziazione delle cellule epiteliali

L’espressione di filaggrina, un marker di differenziazione delle cellule epiteliali, è aumentata nel tempo dopo la lesione (Fig.  7A ). Filaggrina è stata rilevata nell’area della ferita al giorno 8. Il trattamento con PVI ha aumentato l’espressione di filaggrina rispetto al controllo al giorno 11 e 14 post-lesione (p <0,05) (Fig.  7B ).

Figura 7
Figura 7

Il trattamento con Povidone-iodio (PVI) ha migliorato l’espressione di filaggrina. ( A ) sezioni di ferita macchiata immunoistochimica filaggrina rappresentante. Barra della scala = 50 μm. ( B ) Analisi semi-quantitativa dell’espressione di filaggrina. * p <0.05 vs controllo. I dati sono mezzi ± SD, n = 24.

L’inibizione del TGF-β ha invertito il processo di guarigione della ferita migliorato dal trattamento con PVI

SB431542 è un piccolo inibitore di molecole di TGF-β. Il trattamento SB431542 ha ritardato la chiusura delle ferite della pelle nei ratti trattati con PVI (Fig.  8A ). La curva di guarigione indica che l’inibizione del TGF-β ha ritardato significativamente il processo di guarigione della ferita dopo il trattamento con PVI (Fig.  8B ).

Figura 8
Figura 8

L’inibizione del fattore di crescita di trasformazione β ha impedito la promozione della guarigione della ferita della pelle mediante trattamento con Povidone-iodio (PVI). ( A ) Fotografie rappresentative di ferite da ratti trattati con inibitore del fattore di crescita della trasformazione β (SB431542) o veicolo e PVI. ( B ) Contrazione delle ferite (%) al giorno 1-11 dopo la lesione. * p <0,05, ** p <0,01 vs controllo. I dati sono mezzi ± SD, n = 12.

Discussione

I nostri dati hanno mostrato che l’applicazione topica dello 0,5% di PVI promuove la guarigione della ferita cutanea acuta e che il TGF-β ha un ruolo importante in questo processo. Il processo di guarigione delle ferite cutanee coinvolge numerosi tipi di cellule, tra cui neutrofili, macrofagi, fibroblasti e cellule endoteliali. Il TGF-β svolge un ruolo centrale in ogni fase della guarigione delle ferite 12 , 13 , 14 , 15 ; in generale, sopprime la risposta infiammatoria e promuove la formazione di tessuto di granulazione nelle aree ferite 12 . Nel presente studio, è stato trovato che il trattamento con PVI promuoveva la chiusura della ferita e la formazione del tessuto di granulazione, e inoltre, il tessuto di granulazione era più organizzato. L’aumento dell’attività dei miofibroblasti contribuisce alla chiusura della ferita16 , 17 . L’aumentata espressione di α-SMA nelle ferite trattate con PVI suggerisce che il trattamento con PVI possa promuovere il passaggio fenotipico del fibroblasto al miofibroblasto tramite aumento dell’espressione del TGF-β. Ciò è stato confermato dal risultato che l’inibizione del TGF-β con SB431542 ha abolito gli effetti positivi del trattamento PVI sulla chiusura della ferita.

La neovascolarizzazione avvia la formazione del tessuto di granulazione 18 . Pertanto, la formazione organizzata del tessuto di granulazione dopo il trattamento con PVI può essere attribuita all’aumento della crescita di nuove navi. Il TGF-β stimola la migrazione delle cellule endoteliali e l’angiogenesi, quindi è probabile che il trattamento con PVI aumenti la neovascolarizzazione almeno parzialmente attraverso l’up-regulation del TGF-β.

Il TGF-β inibisce la proliferazione dei cheratinociti e ha effetti inibitori sulla riepitelizzazione nel processo di cicatrizzazione cutanea 13 . Tuttavia, la ri-epializzazione non è stata soppressa dalla sovraregolazione indotta dal PVI dell’espressione del TGF-β, il che implica che altri meccanismi che promuovono la ri-epializzazione potrebbero essere coinvolti nella promozione della guarigione della ferita mediante PVI. Ulteriori studi sono giustificati per chiarire questo.

La filaggrina è fondamentale per la guarigione delle ferite e aggrega i filamenti di cheratina in fasci stretti, promuovendo il collasso della cellula in una forma appiattita 19 , 20 . L’aumento dei livelli di filaggrina potrebbe non indicare che il TGF-β ne aumenta direttamente i livelli. Il TGB-β potrebbe favorire la differenziazione delle cellule epiteliali e di conseguenza l’aumento di filaggrina 19 . Ulteriori studi sono giustificati per chiarire i loro ruoli.

È interessante notare che il trattamento con PVI non ha influenzato in modo marcato la fase infiammatoria della cicatrizzazione della ferita cutanea, come dimostrato dalla mancanza di effetti sul numero e sul fenotipo dei macrofagi e delle cellule TNFα +. Tuttavia, il livello di IL-6 nelle aree della ferita nelle prime fasi della guarigione delle ferite è stato ridotto dal trattamento con PVI. IL-6 è una citochina con proprietà pro e anti-infiammatorie ed è un marker di stress, con la capacità di indurre espressione di proteine ​​di fase acuta 21 . Ciò suggerisce che il trattamento con PVI può favorire la guarigione della ferita della pelle attenuando la risposta infiammatoria acuta che comporta congestione ed edema, in linea con lo studio precedente.

Il meccanismo sottostante di aumento del livello di TGF-β nella pelle ferita mediante trattamento PVI rimane ancora sconosciuto, non è chiaro se PVI causi un aumento della sua produzione attraverso l’aumento dei livelli di mRNA o promuova l’attivazione di TGF-β, in aggiunta, quale tipo di cellula gioca il ruolo principale durante il trattamento con PVI è rimasto da chiarire. Tutto ciò doveva essere esplorato in studi futuri.

In sintesi, i nostri dati hanno dimostrato che il PVI ha migliorato la guarigione della ferita della pelle attraverso l’aumento dell’espressione del TGF-β, l’aumento della neovascolarizzazione e il passaggio fenotipico del fibroblasto al miofibroblasto. Anche la ri-epializzazione può essere coinvolta nel processo. Il nostro studio supporta l’uso clinico dell’applicazione topica dello 0,5% di PVI nel trattamento di ferite cutanee senza infezione.

metodi

Modello di ferita e trattamento PVI

Lo studio è stato approvato dal comitato etico di ricerca della terza università medica militare, Chongqing, in Cina, e tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida riguardanti la cura e l’uso degli animali da laboratorio. I ratti Sprague-Dawley maschi (250-260 g) (n = 12 per gruppo) sono stati ottenuti dalla Third Military Medical University (Chongqing, Cina) e ospitati in 12 ore di condizioni di scarsa illuminazione con accesso libero all’acqua e chow di laboratorio standard . Dopo 12 ore di digiuno, i ratti sono stati anestetizzati con Isoflurano al 2% e 80 mg / kg di ketamina IM

Successivamente, la loro pelle dorsale è stata rasata e sterilizzata con etanolo al 70% e sono state generate 4 ferite escissive a tutto spessore con un punzone sterile da 10 mm (laboratori Stiefel, Carolina, USA). Due ferite non sono state curate mentre le altre due sono state rivestite con una garza con 0,5% PVI per 1 ora una volta al giorno dal giorno 0 (il giorno ferito) al giorno 5.

Ratti in un altro gruppo sono stati sottoposti a iniezioni intraperitoneali (IP) di 10 mg / kg di SB431542 (un inibitore del fattore di crescita trasformante β, TGF-β) in soluzione al 5% di DMSO (veicolo) al giorno per 5 giorni. 4 ferite cutanee a tutto spessore sono state create sul dorso di questi ratti usando i metodi descritti. Questi animali sono stati alloggiati individualmente dopo il recupero dall’anestesia. L’area delle ferite è stata regolarmente monitorata con misure planimetriche, in cui le fotografie di ciascuna ferita sono state prese ai punti temporali indicati e quindi analizzate da Immagine J (NIH) (Immagine J, 1.47v, NIH, Bethesda, USA) per calcolare la dimensione della ferita non cicatrizzata.


Istologia

Campioni di pelle ferita sono stati raccolti da coorti di ratti al 3 °, 5 °, 8 °, 11 ° e 14 ° post-infortunio, fissati in formaldeide al 4% tamponata con PBS (pH 7,2) e incorporati in paraffina. Questi sono stati sezionati in sezioni da 5 μm e colorati con H & E.


L’immunoistochimica

Campioni di pelle ferita sono stati raccolti da coorti di ratti negli stessi giorni indicati, fissati in paraformaldeide al 4% per 30 minuti e sottoposti a criosione. Le criosezioni da 5 μm sono state sottoposte a immunoistochimica con anticorpi primari contro l’actina del muscolo liscio alfa (α-SMA), CD34, CD68, ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS), TNFa, IL-6 e filaggrina (Abcam, Cambridge, Regno Unito). Dopo il lavaggio, i campioni sono stati incubati con anticorpi secondari biotinilati, seguiti da incubazione con la soluzione di avidina-HRP. I campioni sono stati sviluppati con soluzione DAB (0,06% DAB in Tris 0,05 M, pH 7,6 con 0,03% di H 2 O 2 ).

Microfotografie da venti campi casuali sono state catturate (40x o 20x o 10x) per l’analisi semi-quantitativa dell’espressione proteica nell’area della ferita. Il numero di cellule di colorazione positive è stato conteggiato per area.


Macchia occidentale

Il tessuto è stato raccolto in punti temporali indicati e lisato in un tampone di lisi (0,5% Nonidet P-40, 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM Nacl, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4 ) con un inibitore della proteasi (1 mM PMSF). Il dosaggio BCA è stato utilizzato per quantificare il livello di proteine. I lisati cellulari (30 μg di proteine) sono stati risolti mediante elettroforesi su gel dodecil solfato-poliacrilammide al sodio (SDS-PAGE) (Immobilon; Millipore, Bedford, MA). Per l’immunoblotting sono stati utilizzati anticorpi primari contro α-SMA, TGF-β, α-tubulina e β-actina (1: 1000) (Abcam, Cambridge, UK) e anticorpo secondario IgG-HRP (1: 2000). I segnali chemiluminescenti sono stati acquisiti usando Storm 860 PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). L’analisi densitometrica è stata eseguita utilizzando il software Image J 5.0. Sono stati eseguiti quattro replicati biologici.


Analisi statistica

Tutti i dati statistici sono presentati come media ± SD. I confronti dei dati sono stati effettuati da t test indipendenti (GraphPad Software, San Diego, CA). Valori P <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Informazioni aggiuntive

Nota dell’editore: Springer Nature rimane neutrale rispetto alle rivendicazioni giurisdizionali nelle mappe pubblicate e nelle affiliazioni istituzionali.

[Tratto da: www.nature.com ]